Möjligt förbättra spermakvalitet

SLC- metoden (Single Layer Centrifugering) kan förbättra spermakvaliteten hos hingstar som har låga dräktighetsresultat. Det visar forskning som gjorts av Jane Morrell vid SLU.

Inom hästaveln är det ett problem att vissa hingstars kylda och utspädda sperma håller för dålig kvalitet. När sådan sperma transporterats för artificiell insemination (AI) av ston ger det en låg dräktighetsprocent.

Att vissa hingstars kylda sperma håller låg kvalitet kan bland annat bero på reaktiva syreföreningar (ROS). Dessa finns i alla vävnader i kroppen. I sperma kan ROS produceras av skadade och döda spermier.

Höga nivåer av ROS förknippas med infertilitet hos människor. Däremot har man tidigare inte trott att det även kan orsaka skador i hingstsperma, på grund av att de antioxidativa system som finns i hingstens ejakulat skulle neutralisera ROS. Dessutom kan spädningsvätskor för sperma ha antioxidativ aktivitet.

Yttre faktorer påverkar

Yttre faktorer kan påverka ROS-produktionen hos enskilda hingstar, så att den överstiger den neutraliserande förmåga som antioxidanterna har. Därför kan hingstspermas överlevnad under lagring variera kraftigt.

Kyld utspädd hingstsperma som transporterats över natten i frigolitlådor har gett mycket varierande resultat i AI. Den tid som spermier behåller sin befruktningsförmåga och livsduglighet varierar från en timme till 2-3 dagar mellan hingstar och mellan ejakulat. Dessutom är det bara 30 procent av hingstarna som producerar ejakulat som fryser bra. Resten producerar en varierande andel av levande spermier (eller inga alls levande spermier) efter upptining.

Såväl fryst som kyld sperma påverkas

Frysförvaring antas ge en ökning av ROS-produktionen, vilket kan orsaka lipidperoxidering i spermiemembranen och kromatinskador. En sådan ökning kan också förekomma under kylförvaring, trots tidigare rapporter om motsatsen. Syftet med detta projekt var därför att undersöka ROS-produktion i kylförvarade och frysta hingstspermaprover, och att fastställa möjliga sätt att neutralisera produktionens negativa effekter.

Användningen av SLC-selektion som ett sätt att förbättra spermieöverlevnaden efter nedfrysning är relevant för branschen, tillsammans med nya tillsatser till frysmediet, såsom amider.
Fördelarna med SLC-selektion för att förlänga spermiernas livsduglighet under kylförvaring, och även i det inseminerade stoet, kräver ytterligare studier i AI-försök.

SLC- metoden (Single Layer Centrifugering) kan förbättra spermakvaliteten hos hingstar som har låga dräktighetsresultat. Det visar forskning som gjorts av Jane Morrell vid SLU.

Inom hästaveln är det ett problem att vissa hingstars kylda och utspädda sperma håller för dålig kvalitet. När sådan sperma transporterats för artificiell insemination (AI) av ston ger det låg dräktighetsprocent.

Att vissa hingstars kylda sperma håller låg kvalitet kan bland annat bero på reaktiva syreföreningar (ROS). Dessa finns i alla vävnader i kroppen och även i sperma, där de produceras av skadade och döda spermier, från cytoplasmiska rester i omogna spermier, och även av leukocyter och cellfragment.

Höga nivåer av ROS förknippas med infertilitet hos människor. Däremot har man tidigare inte trott att det även kan orsaka skador i hingstsperma på grund av att de antioxidativa system som finns i hingstens ejakulat skulle neutralisera ROS. Dessutom kan spädningsvätskor för sperma ha antioxidativ aktivitet.

Dock kan yttre faktorer påverka ROS-produktionen hos enskilda hingstar, vilket överstiger den neutraliserande förmåga antioxidanter har och orsaka den kraftigt varierande överlevnad hos hingstsperma som noterats under lagring.

Varierande resultat med transporterad sperma

Kyld utspädd hingstsperma som transporterats över natten i frigolitlådor, har gett mycket varierande resultat i AI. Det finns en stor variation mellan hingstar och mellan ejakulat i den tid som spermier behåller sin befruktningsförmåga och viabilitet, varierande från en timme till 2-3 dagar.

Dessutom är det bara ~ 30% av hingstarna som producerar ejakulat som fryser bra, resten producerar varierande proportioner av levande spermier (eller inga alls) efter upptining. En ökning av ROS-produktionen antas ske under frysförvaring, vilket kan orsaka lipidperoxidering i spermiemembranen samt kromatinskador. En sådan ökning kan också förekomma under kylförvaring, trots tidigare rapporter om motsatsen.

Ville undersöka ROS i hingstsperma

Syftet med detta projekt var därför att undersöka ROS-produktion i hingstspermaprover, både kylförvarade och frysta och att fastställa möjliga sätt att neutralisera produktionens negativa effekter. Inledningsvis utreddes möjligheten att mäta ROS med en luminometer. Fördelen med en sådan metod skulle vara att den är transportabel och därmed kan användas på olika stuterier för att mäta ROS-produktion i sperma omedelbart efter samlingen.

Det var dock inte möjligt att etablera denna analys vid SLU och i stället utvecklades en flödescytometrisk analys med fluorescerande färgämnen. Denna analys har använts för att analysera ROS-produktion i 45 kylda lagrade spermadoser (15 hingstar, 3 ejakulat per hingst) och 37 upptinade frysta prover (10 hingstar).

Stor variation mellan hingstarna

I de upptinade proverna var spermiernas viabilitet korrelerad med andelen levande spermier som inte producerade ROS (P <0,05), och viabiliteten var också korrelerad med progressiv motilitet (P <0,01). I de kyllagrade AI-doserna varierade ROS-produktionen kraftigt mellan hingstar (intervall 14-50%, median 25%). Det fanns dock inget uppenbart samband mellan ROS-produktion och förlust av viabilitet eller motilitet, vilket tyder på att den spädningsvätska som använts (INRA96) kan neutralisera de skadliga effekterna av ROS på spermier.

Intressant nog visade det sig att ROS inte verkar orsaka lipidperoxidering i hingstspermiernas membran. Detta resultat står i kontrast till resultat för galtspermier, som skadas av ROS och kan bero på att hästens kost (och därmed hästens sädesvätska) har hög nivå naturliga antioxidanter, eller användning av spädningsvätska som innehåller höga halter av antioxidanter.

Spermiernas rörlighet förbättrades

En möjlig positiv roll för låga andelar av sädesvätska upptäcktes i experiment där sädesvätskan sattes tillbaka till SLC-separerade spermier. Dessa utvalda spermier hade högre progressiv motilitet än icke-separerade spermier, och denna ökades ytterligare, om än tillfälligt, genom att sätta tillbaka sädesvätskan till en slutkoncentration av 5 procent till lösningen med framseparerade spermier. En koncentration av 20 procent eller mer av sädesvätskan hade däremot en skadlig effekt på spermiernas rörlighet. Detta resultat kräver ytterligare utredning eftersom det skulle kunna vara ett bra sätt att förbättra motiliteten i kylda eller upptinade spermiedoser för AI, om sädesvätskan tillsattes direkt innan AI.

Funktionaliteten hos hingstspermier som hade preparerats med Single Layer Centrifugering (SLC)-metoden mha Androcoll ™-E, som tidigare utvecklats vid SLU, testades genom intracytoplasmisk spermieinjektion. Spermierna kunde initiera normal utveckling när de injicerades i äggceller från häst och normala blastocyster producerades.

När sperma från lågfertila hingstar användes, hade en högre andel av de oocyter som injicerats med SLC-utvalda spermier en utveckling till blastocyststadiet än de som injiceras med spermier som preparerats med densitetsgradient. SLC-metoden skalades upp så att större volymer ejakulat kan bearbetas. Hela ejakulatet kan nu behandlas i 4-8 50mL-rör, beroende på ejakulatets volym. Den uppskalade metoden användes för att preparera utvalda spermiedoser för artificiell insemination (AI), med resulterande dräktigheter.

Bättre dräktighet efter SLC-bearbetning

Ejakulat från fem problemhingstar bearbetades med SLC och användes för AI, vilket resulterade i dräktighet i 50 procent av inseminationerna, jämfört med 0-20 procent för tidigare oselekterade spermiedoser. En fullskalig fertilitetsstudie med AI pågår för att undersöka olika aspekter av fertilitet hos SLC-selekterade spermier.

I ett samarbetsprojekt med en grupp i Belgien, användes SLC-selekterade spermier för frysförvaring med Botucrio, en ny spädningsvätska innehållande amider, som tros orsaka mindre osmotisk stress för spermier än glycerol och därför mindre ROS-produktion.

Den progressiva motiliteten hos SLC-selekterade spermier efter upptining var i genomsnitt 13 procent bättre än hos oselekterade spermier preparerade för frysning på vanligt vis, vilket var ett utmärkt resultat (M. Hoogewijs, opublicerade observationer). Ytterligare arbete krävs för att optimera frysningsprotokollet för SLC-selekterade spermier och för att testa deras fertilitet efter AI, men SLC-tekniken verkar ge verkligt hopp för att förbättra frysningsprotokollen i hästavelsbranschen.

Sädesvätska tycks ge skydd under frysning

Ytterligare undersökningar som härrör från dessa resultat är att fortsätta att undersöka de eventuella positiva effekterna av små mängder av sädesvätska för att tillfälligt stimulera spermiernas rörlighet och för att skydda spermierna under nedfrysning. Användningen av SLC-selektion som ett sätt att förbättra spermieöverlevnaden efter nedfrysning är även relevant för branschen, tillsammans med nya tillsatser till frysmediet, såsom amider. Fördelarna med SLC-selektion för att förlänga spermiernas viabilitet under kylförvaring, och även i det inseminerade stoet, kräver ytterligare studier i AI-försök.

Ansvarig författare: Stiftelsen Hästforskning 2011-12-06
Forskningsprojekt: Reaktiva syreföreningar (ROS) i hingstsperma; förekomst, spermiepåverkan och möjlighet till kontroll. Ansvarig forskare: Jane Morrell, SLU

Läs mer:

• Veta mest – Länklista till forskningsrapporter om förbättring av spermiekvalitet i hingstsperma.

Vill du läsa forskningsrapporter kring spermakvalitet av Jane Morrell och medarbetare, klicka på länkar nedan:

• Reaktiva syreföreningar (ROS, Reactive oxygen species) i hingstsperma; förekomst, spermiepåverkan och möjlighet till kontroll.
• Processing stored stallion semen doses by Single Layer Centrifugation. Morrell JM, Garcia BM, Pena FJ, Johannisson A. Theriogenology. 2011 Nov;76(8):1424-32. Abstract på engelska.
• Single-layer centrifugation with Androcoll-E can be scaled up to allow large volumes of stallion ejaculate to be processed easily. Morrell JM, Johannisson A, Dalin AM, Rodriguez-Martinez H. Theriogenology. 2009 Oct 1;72(6):879-84. Abstract på engelska.
• Single layer centrifugation of stallion spermatozoa improves sperm quality compared with sperm washing. Morrell JM, Rodriguez-Martinez H, Johannisson A. Reprod Biomed Online. 2010 Sep;21(3):429-36. Abstract på engelska.
• Single layer centrifugation of stallion spermatozoa consistently selects the most robust spermatozoa from the rest of the ejaculate in a large sample size. Morrell JM, Rodriguez-Martinez H, Johannisson A. Equine Vet J. 2010 Oct;42(7):579-85. Abstract på engelska.
• Morphology and chromatin integrity of stallion spermatozoa prepared by density gradient and single layer centrifugation through silica colloids. Morrell JM, Johannisson A, Dalin AM, Rodriguez-Martinez H. Reprod Domest Anim. 2009 Jun;44(3):512-7. Abstract på engelska.
• Restoration of seminal plasma to stallion spermatozoa selected by colloid centrifugation increases sperm progressive motility but is detrimental to chromatin integrity. Morrell JM, Pihl J, Dalin AM, Johannisson A. Theriogenology. 2012 Apr 9. Abstract på engelska.
• Single layer centrifugation of stallion spermatozoa through Androcoll™-E does not adversely affect their capacitation-like status, as measured by CTC staining. Bergqvist AS, Johannisson A, Bäckgren L, Dalin AM, Rodriguez-Martinez H, Morrell JM. Reprod Domest Anim. 2011 Feb;46(1):e74-8. Abstract på engelska.
• Colloidal centrifugation with Androcoll-E prolongs stallion sperm motility, viability and chromatin integrity. Johannisson A, Morrell JM, Thorén J, Jönsson M, Dalin AM, Rodriguez-Martinez H. Anim Reprod Sci. 2009 Nov;116(1-2):119-28. Abstract på engelska.
• Stallion Sperm Viability, as Measured by the Nucleocounter SP-100, Is Affected by Extender and Enhanced by Single Layer Centrifugation. Morrell JM, Johannisson A, Juntilla L, Rytty K, Bäckgren L, Dalin AM, Rodriguez-Martinez H. Vet Med Int. 2010;2010:659862. Abstract på engelska.
• Centrifugation on a single layer of colloid selects improved quality spermatozoa from frozen-thawed stallion semen. Macías García B, Morrell JM, Ortega-Ferrusola C, González-Fernández L, Tapia JA, Rodriguez-Martínez H, Peña FJ. Anim Reprod Sci. 2009 Aug;114(1-3):193-202.Abstract på engelska.
• Sperm morphology and chromatin integrity in Swedish warmblood stallions and their relationship to pregnancy rates. Morrell JM, Johannisson A, Dalin AM, Hammar L, Sandebert T, Rodriguez-Martinez H. Acta Vet Scand. 2008 Jan 7;50:2. Fri forskningsartikel på engelska.
• Androcoll-E large selects a subset of live stallion spermatozoa capable of producing ROS. Macías-García B, González-Fernández L, Gallardo-Bolaños JM, Peña FJ, Johannisson A, Morrell JM. Anim Reprod Sci. 2012 Apr 4. Abstract på engelska.
• Single-layer centrifugation through colloid positively modifies the sperm subpopulation structure of frozen-thawed stallion spermatozoa. Macías García B, González Fernández L, Morrell JM, Ortega Ferrusola C, Tapia JA, Rodriguez Martínez H, Peña FJ. Reprod Domest Anim. 2009 Jun;44(3):523-6. Abstract på engelska.
• Freezing stallion semen with the new Cáceres extender improves post thaw sperm quality and diminishes stallion-to-stallion variability. Rodríguez AM, Ferrusola CO, García BM, Morrell JM, Martínez HR, Tapia JA, Peña FJ. Anim Reprod Sci. 2011 Aug;127(1-2):78-83. Abstract på engelska.
• Comparison of density gradient and single layer centrifugation of stallion spermatozoa: yield, motility and survival. Morrell JM, Dalin AM, Rodriguez-Martinez H. Equine Vet J. 2009 Jan;41(1):53-8. Abstract på engelska.
• Lipid peroxidation, assessed with BODIPY-C11, increases after cryopreservation of stallion spermatozoa, is stallion-dependent and is related to apoptotic-like changes. Ortega Ferrusola C, González Fernández L, Morrell JM, Salazar Sandoval C, Macías García B, Rodríguez-Martinez H, Tapia JA, Peña FJ. Reproduction. 2009 Jul;138(1):55-63. Abstract på engelska.
• Pregnancies following artificial insemination with spermatozoa from problem stallion ejaculates processed by single layer centrifugation with Androcoll-E. Morrell JM, Mari G, Kútvölgyi G, Meurling S, Mislei B, Iacono E, Rodriguez-Martinez H. Reprod Domest Anim. 2011 Aug;46(4):642-5. Abstract på engelska.
• Effective removal of equine arteritis virus from stallion semen. Morrell JM, Geraghty RM. Equine Vet J. 2006 May;38(3):224-9. Abstract på engelska.
• Practical applications of sperm selection techniques as a tool for improving reproductive efficiency. Morrell JM, Rodriguez-Martinez H. Vet Med Int. 2010 Aug 4;2011. Abstract på engelska.